只因不小心被一只受过放射性感染的蜘蛛咬伤，平凡瘦弱的高中生彼得·本杰明·帕克（尼尔·帕特里克·哈里斯 Neil Patrick Harris 饰）的人生便发生了翻天覆地的变化。从此以后，他穿上红蓝相间的紧身服，戴上面具，凭借发射出的蜘蛛丝穿梭在喧哗闹市的每一个角落。“能力越大，责任越大”，彼得以蜘蛛侠的身份，和破坏城市及世界和平的恶势力作斗争。全新的征程，更强大的敌人，女武士鹿田、The Talon、电王（Ethan Embry 配音）、蜥蜴人（罗布·赞比 Rob Zombie 配音）、银貂（Virginia Madsen 配音）等可怕对手相继登场。蜘蛛侠从不退却，勇敢地迎上前去……

中学生彼特·帕克 （ 托比·马奎尔 饰）自幼父母双亡，与心爱的舅舅、舅妈一起生活在纽约皇后区，过着一个普通学生的生活。就像来自美国许多破碎家庭的孩子一样，尽管彼得人很聪明却很害羞，因此，常常受到一些同学的嘲弄，除了比他更懦弱的哈里·奥斯伯恩 （ 詹姆斯·弗兰科 饰），彼特没有任何朋友，不过彼得一直对邻居家的女孩玛丽 （ 克尔斯滕·邓斯特 饰）情有独钟。但哈里·奥斯本也同他一样爱上了玛丽。在一次学校组织的活动中，彼得和同学们去看有关蜘蛛的科学展览。正在拍照的彼得没有注意一只基因变异的蜘蛛从大棚的吊灯上顺着蛛丝猛然掉落，慌不择路间在彼得的手上咬了一口，彼得的手马上肿了起来。回家之后彼得在发了一夜的高烧后，突然发现自己竟被神奇地赋予了蜘蛛的那种能够感知危险来临的第六感，还拥有了许多非同寻常的能力：他成了一只力量超凡、身手敏捷、可以飞岩走壁、发网状粘液的“蜘蛛人”。像所有传说中的英雄人物一样，彼得为自己设计了一套红色蜘蛛紧身服和面具。不久他出现在电视转播的摔跤比赛场上，用自己神奇的力量打败了强悍的对手。但摔跤比赛的主办人拒绝发给彼得3000美元的奖金，理由是他赢得太快了，彼得因此怀恨在心。没想到天赐良机，彼得正好撞上从那个主办人办公室里逃出来的窃贼，为报复主办人他放过了窃贼。由于彼得的自私，他因此付出了沉重的代价——正是这个窃贼杀害了他亲爱的舅舅。作为蜘蛛侠，彼得给了那个窃贼应有的惩罚，但他深受悔恨的折磨。他恨自己没有早日行侠仗义，并在悔恨中想起了舅舅跟他说过的一句话：“能力越大，那你的责任也就越大”。彼得将这句话铭记在心，他决定献身于与罪恶的斗争之中。从此，在城市的每一个角落，只要有犯罪行为，蜘蛛侠就会从天而降，协助警方把罪犯绳之以法。哈里的父亲诺曼·奥斯本 （ 威廉·达福 饰）原本既是一个有钱有势的生意人又是一个著名的科学家，在一次严重失误的科学实验中，他意外地发现了一个神秘的配方可以提高他的智商，增强他的力量。于是诺曼的野心逐渐显露，他杀害了助手并以邪恶的化身——绿魔出现在世上，而平常则仍是一位正人君子。正是这种迷惑使哈里始终以为他是个好父亲，而彼得也险些遭到他的毒手。绿魔劫持了玛丽做人质，要挟蜘蛛侠，一场不可避免的决战终于来临了。在一座天桥上，搏斗极为惨烈又惊心动魄，彼此的胜负仅在毫厘之间。当蜘蛛侠抢先一步击中绿魔的要害后，彼得发现他竟是哈里的父亲。诺曼一边哀求彼得手下留情，一边却突发冷箭，但这终究未能使他逃脱被惩处的下场 。